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发表于 2025-9-1 20:51:14
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原文：Mol. Biol. Evol. 40(4):msad055 https://doi.org/10.1093/molbev/msad055
在广泛杂交背景下基于全基因组数据追溯东部狼（Eastern wolf, Canis lycaon）的起源
作者： Sibelle T. Vilaça、Michael E. Donaldson、Andrea Benazzo、Tyler J. Wheeldon、Maria Teresa Vizzari、Giorgio Bertorelle、Brent R. Patterson、Christopher J. Kyle
摘要
加拿大东南部栖息着一群正在杂交的似狼犬科动物，这引发了关于它们的分类、起源和杂交事件时间点的基本问题。 具体来说，东部狼（Canis lycaon）一直是重大争议的主题，它被视为一个需要保护的独特分类实体，或者是郊狼（C. latrans）和灰狼（C. lupus）近期杂交的产物。 线粒体DNA分析显示，有证据表明东部狼是在北美进化的犬科动物。 相比之下，核基因组研究表明，将东部狼描述为一个杂交实体最为恰当，但杂交事件的时间尚不清楚。 为了检验与这些相互矛盾的发现相关的假设，我们对25个个体的全基因组进行了测序，这些个体代表了现存的、来源已知且当代杂交水平明确的加拿大似狼犬科动物类型。 在此，我们提供的数据将东部狼描述为一个独特的分类实体，它在过去约67,000年里与灰狼分开进化，并在约37,000年前与郊狼发生过一次基因渗入事件。 我们发现，五大湖狼是在末次冰期后（约8,000年前）由灰狼和东部狼基因渗入产生的，而东部郊狼则是在上个世纪由“西部”郊狼和东部狼基因渗入产生的。 东部狼的核基因组似乎受到了历史上和当代的与灰狼和郊狼的基因流影响，然而，目前栖息在加拿大东南部有限范围内的东部狼仍然保持着其进化独特性。
关键词： 全基因组、基因渗入、东部狼、红狼、五大湖狼、东部郊狼。
引言
基因组研究不断揭示物种间杂交事件的广泛性，包括一系列哺乳动物，以及这些事件在局域适应和物种形成中扮演的角色。 越来越多的全基因组研究与精密的统计分析相结合，表明古代杂交事件很普遍，由这些杂交事件产生的基因渐渗位点仍在许多现今物种的基因组中分离。 区分古代和近期的杂交事件非常重要，因为与人为影响相关的杂交通常被视为对亲本物种的威胁。 然而，当亲本物种的适应性可能因快速变化的栖息地和选择压力而受损时，需要平衡这种观点。 在这种情况下，杂交可能有助于快速适应和遗传拯救，从而在担心亲本物种被基因淹没的同时，维持生物多样性和生态系统完整性。
北美洲栖息着表型多样的似狼犬科动物群体，它们的活动范围通常重叠，并且在某些地区已知会广泛杂交，而在其他地区则不然。 在加拿大东南部，存在一系列正在杂交的似狼犬科动物，包括东部狼（Canis lycaon）、五大湖狼（C. lupus x C. lycaon）和东部郊狼（C. latrans var.）。 在1970年代中期，Kolenosky和Standfield（1975）描述了加拿大安大略省“灰”狼的形态和生态变异范围，包括：1）主要出现在苏必利尔湖以北的北部和中部北方森林中的“安大略”型，后被称为五大湖狼； 2）主要出现在苏必利尔湖和乔治亚湾以东的针阔混交林中的“阿尔冈金”型，后被称为东部狼； 3）显然出现在安大略湖以北受人类影响更多景观中的“特威德”型，后被称为东部郊狼。
使用分子标记的研究表明，阿尔冈金省立公园（“阿尔冈金”型或东部狼）内外的似狼犬科动物在遗传上相对于郊狼和灰狼都显得独特，而公园区域外的似狼犬科动物则受到与郊狼（“特威德”型或东部郊狼）或灰狼（“安大略”型或五大湖狼）杂交的更严重影响。 尽管先前的研究已经注意到东部狼的遗传独特性，但解决这些似狼犬科动物的分类和起源问题却更具挑战性，其依据的基础要么是：1）包括郊狼（C. latrans）和灰狼（C. lupus）以及这两种物种的各种杂交体的双物种模型； 要么是：2）包括东部狼（也可能包含红狼）作为一个独立于郊狼和灰狼的独特物种的三物种模型。 在三物种模型中，东部狼被认为是在郊狼和灰狼之间充当基因流桥梁的角色。 在这两个相互竞争的模型之间做出抉择一直存在争议，并且可能在时间视角上过于局限，因为最近的研究表明，在区分这些模型时，应同时考虑这些犬科动物之间的古代和近期杂交。
包含加拿大东南部似狼犬科动物样本的全基因组测序研究得出结论，东部狼很可能起源于杂交。 具体来说，基因组研究显示，东部狼和五大湖狼虽然形成一个独特的遗传群体，但在遗传上介于灰狼和郊狼之间。 这些数据被用来反驳东部狼是一个独立物种的假说，并表明它们更有可能是灰狼和郊狼基因渗入的结果，但对于杂交产生东部狼和五大湖狼的时间线尚不清楚。 东部狼在相对遥远的过去与灰狼发生历史性杂交，在相对近期的过去与郊狼发生杂交，再加上当代东部狼与灰狼和郊狼的杂交，使得辨别清晰的分类区别和解释现今似狼犬科动物的多样性变得困难。 这种清晰度的缺乏使得有效的保护和管理规划难以进行，因为根据这些似狼犬科动物的分类和起源，以及它们之间杂交的时间和相对程度，将为这些实体提供不同级别的保护。
为了将旨在确定现今似狼犬科动物起源和杂交模式的当前遗传评估置于背景中，地质记录显示灰狼在过去30万年里持续存在于北美。 然而，当代的北美灰狼可能是约25,000年前一次白令陆桥灰狼扩张的后代，这次扩张取代了所有北美中部的灰狼，并导致了郊狼的扩张。 其他假说包括，现存狼类如Pacheco等人（2022）提出的，更早地从白令陆桥狼分化而来。 也有基因组证据表明，北美所有现存的似狼犬科动物至少有10-20%的郊狼血统，这反映了8-10万年前的狼/郊狼杂交事件。 尽管一些解释认为白令陆桥灰狼取代了一种北美灰狼，但Sacks等人（2021）基于历史样本的线粒体DNA（mtDNA）推测，北美的本土狼可能是红狼。 这些mtDNA数据进一步表明，红狼在约6万年前与郊狼分化，其“最纯正”的后代现在仅限于加拿大安大略省中部的阿尔冈金省立公园大区，在那里它们通常被称为东部狼。 Kolenosky和Standfield（1975）对各种狼形态的描述，以及关于安大略省中部东部狼杂交/“纯度”的遗传发现，都表明该地区在研究北美似狼犬科动物相互关系方面具有特别的意义。
我们研究的主要目标是填补我们对东部狼遗传学和进化史理解上的知识空白。 鉴于过去的研究强调了东部狼相对于灰狼、郊狼和其他似狼犬科动物的独特性遗传聚类，我们旨在进一步确定东部狼基因组的哪些部分与灰狼和郊狼不同，并更好地评估北美东北部似狼犬科动物群体之间杂交事件的时间。 我们使用了几种分析方法来确定东部狼特有血统的比例，并使用新颖的统计方法来评估杂交事件的时间。 我们的工作是在两种模型的背景下进行的：一种是双物种模型，该模型将灰狼和郊狼确定为不同物种，并产生了各种杂交体，包括东部狼、红狼、五大湖狼和东部郊狼； 另一种是三物种模型，该模型将灰狼、郊狼和东部狼（包括红狼）确定为不同物种，并产生了特定的杂交体，包括五大湖狼和东部郊狼。 为了回应先前基因组研究的批评，我们对来源已知、当代杂交水平明确的新样本进行了更高覆盖度的全基因组测序，并使用了更具代表性的加拿大犬科动物类型样本作为适当的外群（包括在阿尔伯塔省采样的“西部”郊狼和灰狼的纯种群体）。
结果
种群结构
我们对来自加拿大的25个犬科动物基因组进行了测序（平均覆盖度：18.2X；覆盖度范围：14.8X至21.1X），其中包括以下每种犬科动物类型的五个个体：阿尔伯塔省的“西部”郊狼、安大略省的东部郊狼、来自阿尔冈金省立公园的安大略省东部狼、安大略省的五大湖狼和阿尔伯塔省的灰狼。 我们将这些新的犬科动物基因组与先前发表的犬科动物基因组相结合，使分析数据集中的基因组总数达到68个。
使用所有核SNP的系统发育网络分析显示，东部狼形成了一个独立于灰狼和郊狼的群体（图2a）。 同样，红狼也形成了一个独立的群体，但在遗传上比灰狼更接近郊狼（图2a）。 五大湖狼和东部郊狼在遗传上分别更接近灰狼和郊狼（图2a）。 Fst统计数据显示（图2b），郊狼内部和灰狼内部的分化较低，但墨西哥狼与其他灰狼高度分化。 东部狼与安大略省五大湖狼的成对Fst值最低（Fst=0.11），其次是与安大略省东部郊狼（Fst=0.15）和阿尔伯塔省灰狼（Fst=0.16）。
基因渗入分析使用了两个数据集：一个是包含低覆盖度和高覆盖度基因组的完整数据集（n=67），另一个是仅包含较高覆盖度基因组（>10x，n=46）的简化数据集。 当包含低覆盖度基因组时，K=3的划分支持灰狼、郊狼和东部狼形成独立的簇；K=4的划分支持北美灰狼和欧亚灰狼形成独立的簇；K=5的划分支持红狼形成一个独立的簇。 值得注意的是，在更高的K值下，五大湖狼和东部郊狼都分别聚类。 使用完整数据集的基因渗入分析反映了先前研究中观察到的种群划分，但在东部狼和红狼中未检测到更精细的种群结构或基因渗入信号。 当仅使用高覆盖度基因组（>10x）时，东部狼显示出与灰狼和郊狼的基因渗入，其比例分别为较大和较小（图2c），根据Evanno方法，最佳K值为K=4。 此外，东部狼拥有一个独特的遗传成分，这是五大湖地区以外的灰狼或郊狼种群所不具备的（图2c）。 红狼也拥有一个独特的遗传成分，并显示出与郊狼和灰狼的基因渗入，其比例分别为较大和较小（图2c）。 五大湖狼的血统主要来源于灰狼，并有相当一部分来自东部狼的基因渗入，以及有限的来自郊狼的基因渗入（图2c）。 东部郊狼的血统主要来源于郊狼，并有相当一部分来自东部狼的基因渗入，以及有限的来自灰狼的基因渗入（图2c）。
种群动态与遗传多样性
使用多序列马尔可夫溯祖模型（MSMC2）进行的人口历史分析显示，北美犬科动物在进化史中有效种群大小（Ne）出现波动，所有种群的Ne最低水平出现在过去几千年内（图3a）。 在末次冰期开始前（约120,000年前），观察到所有犬科动物群体的Ne下降，随后在冰期开始时稳定下来，并且轨迹出现分离，表明其人口历史部分独立。 虽然某些犬科动物群体（如阿尔伯塔郊狼、阿尔伯塔灰狼、北极狼、黄石公园狼）的Ne持续下降，但我们观察到其他一些犬科动物群体（如东部狼、红狼、五大湖狼和东部郊狼）的Ne略有增加，随后急剧下降。 事实上，东部狼在末次冰期期间的Ne高于郊狼和灰狼种群。
个体水平的近交（Fis）和杂合度估计显示，与其他北美犬科动物相比，加拿大似狼犬科动物具有更高的杂合度和更低的近交水平（图3b）。 最值得注意的是，东部狼和五大湖狼在所有个体中的近交水平最低，这可能是它们之间以及分别与东部郊狼和灰狼当代基因流的结果。 在加拿大，“西部”郊狼的平均近交水平高于其他犬科动物，尽管灰狼的平均杂合度低于其他犬科动物。 这些结果表明，“西部”郊狼的遗传多样性高于灰狼，但近交系数也更高。 我们在本研究使用的样本中未发现任何近期的同源共祖现象。 考虑到基因组中的总纯合区域（FROH），红狼和灰狼的FROH值最高，而“西部”郊狼和东部郊狼的FROH值最低。 尽管这里使用的两种方法估计的FROH值不同，但它们高度一致（皮尔逊相关系数=0.91）。
犬科群体间的过去与近期基因流
为了研究犬科群体间的过去基因流，我们使用了成对种群间迁移率的时间依赖性估计（MSMC-IM）。 最高的迁移率出现在东部狼 x 东部郊狼和东部狼 x 五大湖狼之间（图4）。 这表明东部狼与五大湖地区的其他犬科群体之间存在基因流，且在过去2000年内迁移率更高（图4a）。 考虑到累积迁移概率（M(t)，图4b），在东部狼 x 东部郊狼和东部狼 x 五大湖狼之间也观察到了一个平台期。 这种模式表明了通过过去迁移事件融合的血统量，并可以被解释为对过去基因渗入比例的保守估计。 虽然在与灰狼的其他组合中也可以观察到平台期，但这些平台期比与五大湖狼和东部郊狼的平台期更古老（约5000年前）。 因此，过去与灰狼的基因流涉及更古老的灰狼群体，并且对基因组的贡献更大[由M(t)比例指示]。 我们还注意到，对于五大湖狼和东部郊狼的组合，M(t)从未达到0（即完全分离），这一模式可以通过这些群体之间持续的基因流来解释。 然而，东部郊狼是一个近期的群体（见下文和图5），与东部狼的迁移率估计早于其在安大略省的推测起源。 因此，我们将观察到的东部狼和东部郊狼之间的过去基因流，特别是在后者于上个世纪起源之前的基因流，解释为当代的东部郊狼是与东部狼杂交的“西部”郊狼的代表。 同样，观察到的东部狼和五大湖狼之间的过去基因流，特别是在末次冰期后五大湖狼起源之前的基因流，被解释为当代的五大湖狼是与东部狼杂交的灰狼的代表。
为了明确检验双物种模型与三物种模型，并阐明东部狼的进化史，我们使用近似贝叶斯计算通过随机森林（ABC-RF）对这些模型进行了评估。 我们设计的模型旨在推断东部狼是起源于杂交（灰狼 x 郊狼杂交），还是源于一个单一群体并伴有推定的后序基因渗入（即新遗传背景融入现有谱系）。 如果它们起源于杂交，那么从灰狼和郊狼分离的时间估计将显示出一个重叠的后验分布（假设杂交混合不是不对称的）。 否则，源于一个群体的起源日期将早于随后的基因渗入日期。 此外，我们的模型允许基因渗入比例接近于0。 该基因渗入参数的后验估计值接近0，表明是单一来源且没有后序基因渗入。
具有较高后验概率的模型（模型2，后验概率=0.76）推断东部狼源于一个灰狼种群（图5）。 郊狼和灰狼之间的分化时间估计为914,619年前（95%置信区间[CI]: 820,493-1,047,184; r²=0.11）（图5），这与之前的估计相符。 东部狼从灰狼中分离出来发生在66,595年前（95% CI: 19,746-281,139; r²=0.61）（图5）。 我们的结果显示，东部狼的祖先种群已经与灰狼分开进化了约67,000年，并在此期间发展出了种群特有的血统，正如在Structure和NGSadmix结果中观察到的那样（图2c）。 在这次分化之后，于37,601年前（95% CI: 7,721-164,817; r²=0.89）发生了一次与郊狼的基因渗入事件（图5）。 五大湖狼是在末次冰期后（7,899年前；95% CI: 1,176-18,918; r²=0.24）由灰狼和东部狼基因渗入产生的（图5）。 东部郊狼是由“西部”郊狼和东部狼基因渗入产生的，但这次基因渗入事件的时间无法被可靠地估计（r²=0.01），这可能反映了近期（即约100年前）郊狼对北美东部的殖民以及伴随的与东部狼和家犬的杂交。 鉴于复杂的人口情景，并非所有的人口参数都能被准确估计，包括迁移率，其显示出较低的r²值（r²≤0.10）。 最后，我们使用后验预测检验来评估所选模型是否能够生成观察到的遗传多样性，方法是通过主成分分析比较模拟数据和观测数据。 我们的ABC-RF分析中最受支持的模型及其参数的估计值，能够重现观测数据中发现的遗传变异模式。
使用AdmixtureBayes估计的最拟合图谱支持了从ABC-RF分析中选出的模型，其基因渗入事件和比例是一致的。 具有最高后验概率的拓扑结构（PP=0.38，图5b）显示，东部狼起源于一次早期的基因渗入事件，该事件发生在郊狼和灰狼谱系首次分裂之后（图5b）。 这个祖先混合群体拥有比郊狼血统更大比例的狼血统（58%狼 x 42%郊狼），这与ABC-RF的估计相似（54%狼 x 46%郊狼）。 五大湖狼和东部郊狼起源于更近期的基因渗入事件，其血统比例与ABC-RF和Structure分析的结果相符。 虽然五大湖狼和东部郊狼都含有东部狼的成分，但它们源于东部狼进化分支上两个不同的祖先群体（图5b中的节点n2和n4）。 这一结果支持了五大湖狼的起源更古老，其包含的东部狼血统可能与当前东部狼的遗传构成不同。
全基因组的基因流模式
为了研究东部狼基因组中的差异性血统模式、基因渗入历史和差异进化，我们使用了Chromopainter中实现的“染色体涂色”方法来识别基因组上的局部血统，并总结有关祖先关系的信息。 东部狼基因组的近三分之二为其群体所特有。 平均而言，一个东部狼个体的基因组被“涂色”为63%的东部狼、19%的灰狼和18%的郊狼。 我们估计了被识别为东部狼血统的片段与其他犬科动物种群的成对遗传距离（图6a）。 我们的结果显示，东部狼与欧亚灰狼的遗传距离比与其他北美犬科动物种群的遗传距离更小（图6a）。
我们还提取了被分配到三个参考群体之一（即东部狼、灰狼、郊狼）的染色体片段的长度，因为这个度量可以提供关于基因渐渗片段是源于古代还是近期基因流的信息（分别为短和长）。 在东部狼内部（图6b），被涂色为东部狼血统的片段的平均长度，比被涂色为灰狼或郊狼血统的渐渗片段更长（东部狼长度=80.90 kbp；灰狼长度=40.11 kbp；郊狼长度=34.94 kbp）。 然而，仅考虑渐渗片段（图6b），被涂色为郊狼血统的片段的最大长度比被涂色为灰狼血统的片段更长（郊狼最大长度=3.31 Mb；灰狼最大长度=2.69 Mb），这表明在一些东部狼中，郊狼片段的渐渗比灰狼片段的渐渗更为近期。
讨论
在此，我们在北美似狼犬科动物分类学的双物种与三物种模型的背景下，评估了东部狼的进化史以及北美东北部似狼犬科动物群体之间杂交事件的时间点。 我们试图解决这些竞争模型的尝试与以往的研究不同，因为我们在分析中结合了：1）来自已知没有当代杂交的种群的灰狼和郊狼样本，作为外群；以及2）具有已知当代杂交水平的东部郊狼和五大湖狼样本。 此外，我们使用了多种分析方法来确定东部狼特有的血统比例，并使用了新颖的方法（即ABC-RF, AdmixtureBayes）来评估杂交事件的时间。
多项证据支持东部狼是一个独特的分类实体，具有种群特有的血统，源于末次冰盛期前存在于北美的灰狼种群。 尽管能获得的已发表基因组代表很少，我们的分析显示红狼也表现出独特的血统成分，但与东部狼相比，它受到与郊狼的当代基因流影响更大。 我们还发现，当代东部狼显示出与郊狼和灰狼的古代和近期基因流的证据，这与其他近期研究相似。
我们的结果，在包含低覆盖度基因组数据的情况下，得出了与以往使用相同数据和分析来解决双物种与三物种模型竞争的研究所得出的类似模棱两可的结论。 然而，当仅使用高覆盖度基因组时，我们发现东部狼和红狼都具有私有的基因组特征，以及与灰狼和郊狼的基因渗入证据。 在没有纯种代表可用时（例如，没有当代基因渗入的东部狼），使用更高覆盖度的基因组非常重要，因为像NGSadmix这样的分析在处理低覆盖度基因组数据时，可能会掩盖像东部狼这样结构化种群中的基因渗入模式。 虽然较低覆盖度的基因组在其他研究中发挥了重要作用，但在没有非混合种群作为参考来估计基因流时，应优先考虑更高覆盖度的基因组。
我们研究的另一个关键发现包括对祖先种群动态的估计，显示了祖先郊狼和灰狼种群都有较大的有效种群规模（Ne），随后在末次冰盛期后，当白令陆桥灰狼殖民北美时出现了瓶颈。 这些结果表明，北美犬科动物深受末次冰期的影响，这可能是由于低温和栖息地减少共同导致了种群瓶颈和替换。 现代人类对美洲的殖民以及对大型猎物的竞争，也被认为对这些犬科动物种群的Ne下降有所贡献。 然而，我们不能排除祖先Ne值因被认为在末次冰期期间发生的基因渗入事件（即新谱系进入基因组）而更高。
什么是东部狼？
以往的研究曾使用化石、mtDNA、微卫星标记、简化代表性基因组数据以及最近的全基因组数据，来评估关于东部狼分类地位的竞争性假说——即它被认为是郊狼和灰狼的杂交体，或是一个独立的物种。 通过多方面的分析组合，我们发现这两种假说在某种程度上都与我们的结果兼容。 从全基因组分析来看，东部狼似乎介于郊狼和灰狼之间（图2a和2b）。 然而，在更精细的分析中，东部狼显示出独特的血统成分，并有证据表明与郊狼和灰狼存在古代和近期的基因渗入（图3b、5和6）。 因此，东部狼拥有嵌合式基因组，尽管与郊狼和灰狼有古代和近期的基因渗入，但仍保留了独特的血统成分。 Chromopainter分析例证了这一模式，它显示私有的东部狼基因组区域与来自郊狼和灰狼的短和长渐渗片段交错排列。 短的渐渗片段是古代基因流的信号，而长的渐渗片段是近期基因流的信号。 因此，我们的结果支持东部狼在与灰狼分化后，作为一个独立的进化谱系，随后与郊狼和灰狼发生了古代和近期的基因渗入。 栖息在阿尔冈金省立公园地区的当代东部狼的基因组，似乎是一个由在北美东部幸存下来的古代东部狼种群与灰狼和郊狼共同构成的嵌合体。
基于全基因组数据，ABC-RF和基因渗入图分析最支持的模型（图5）表明，东部狼是一个独特的分类实体，但源于灰狼。 东部狼似乎在大约67,000年前与灰狼分化，在大约38,000年前与郊狼发生基因渗入，并与郊狼和灰狼保持着当代的基因流。 我们认为模拟模型与观察到独特的东部狼片段与灰狼的相似性高于与郊狼的相似性的结果是一致的（图6a）。 鉴于东部狼在过去约67,000年里与灰狼分开进化，它们有足够的时间积累可与其他犬科动物区分的多态性。
基于mtDNA和Y染色体数据的先前研究表明，东部狼是一个与郊狼关系密切的独立物种，因此是从新大陆犬科动物谱系进化而来的。 东部狼起源的特征性mtDNA和Y染色体单倍型聚类在郊狼分支内，但又独立于其中，并且包含在非杂交郊狼种群中未观察到的差异单倍型。 这些数据似乎与常染色体数据相悖，后者表明东部狼是一个源自灰狼的独特分类实体，因此是从旧大陆犬科动物谱系进化而来的。 大约38,000年前（或根据Bergström等人2022年的研究，更古老的事件）东部狼和郊狼之间的基因渗入事件，可能解释了东部狼中存在郊狼样mtDNA和Y染色体单倍型，这些单倍型构成了一个分化的谱系。 在这次基因渗入事件之后，古代东部狼种群可能“继承”了郊狼分支的mtDNA和Y染色体单倍型，这些单倍型随后发生分化，现在被认为是东部狼起源的。 我们的估计与Wilson等人（2000）提出的东部狼和郊狼之间15-30万年的分化时间不同，但与基于现代和古代样本序列的mtDNA溯祖估计相符。
Bergström等人（2022）对古代犬科动物样本的基因组调查发现，所有北美似狼犬科动物都含有显著比例的郊狼样血统，包括那些与郊狼没有当代杂交的种群。 有趣的是，他们报告说，来自育空地区的两只更新世狼拥有郊狼样的mtDNA。 Bergström等人（2022）提出，狼和郊狼在大约70万年前分化，有证据表明郊狼和狼在约8-10万年前发生了杂交； 这意味着更新世郊狼的活动范围比以前认为的更靠北，或者郊狼/狼的基因渗入通过狼种群向北传播。 正如Bergström等人（2022）所假设的，灰狼和郊狼在8-10万年前发生的基因渗入，位于我们ABC-RF参数估计中东部狼从灰狼分化的95%置信区间内（图5）。 因此，我们对郊狼单倍型渐渗到东部狼所源于的灰狼种群的估计，与基于古DNA的结果是兼容的。 这意味着在我们分析中识别出的约38,000年前的基因渗入事件，可能是次级渐渗单倍型的来源。 这种情景虽然是推测性的，但它意味着独特的东部狼基因组特征主要反映了灰狼的常染色体血统，同时也包含了渐渗的郊狼常染色体血统。 尽管我们不能排除东部狼与其他曾栖息在北美的古代郊狼形态（例如C. latrans orcutti）可能发生的杂交是东部狼中观察到的郊狼样mtDNA和Y染色体单倍型来源的可能性，但更多来自已灭绝犬科动物的基因组数据或许很快能阐明这些关系。
最近的研究表明，尽管灰狼种群在过去30万年里一直存在于北美，但这些种群可能在末次冰盛期后被灭绝了。 因此，这些末次冰盛期前的种群将不会在现存灰狼的遗传多样性中有所体现，现存灰狼是末次冰盛期后从白令陆桥扩张并取代了本土更新世灰狼种群的后代。 在末次冰盛期，北美被冰盖覆盖，犬科动物种群可能退缩到南部地区，使得北部地区没有犬科动物存在，或在白令避难所内。 相比之下，我们的结果表明，前白令时期的灰狼种群在北美东部幸存下来，并且一些末次冰盛期前的灰狼血统保留在东部狼体内。 这一解释得到了东部狼基因组片段与欧亚灰狼之间遗传距离较小的佐证。 因此，东部狼的基因组血统似乎比现代北美灰狼更接近欧亚灰狼。
虽然我们认为东部狼似乎是一个具有种群特有血统的独特分类实体，但我们也承认我们对东部狼起源的解释与其他近期基因组研究的解释大体兼容。 Bergström等人（2022）和Sinding等人（2018）发现，狼和郊狼之间的基因渗入，其中狼的血统源于末次冰盛期后（而我们的数据认为是末次冰盛期前），最能解释他们的数据，但他们也承认其他复杂的血统可以解释观察到的模式。 总的来说，如果没有对古代犬科动物样本的进一步分析，描述导致今天东部狼的确切祖先事件可能是无法实现的，但我们坚持认为，东部狼特有的基因组特征最能描述一个具有种群特有血统的独特分类实体。
红狼
来自两个高覆盖度红狼基因组的数据显示，它们拥有一个不同于东部狼的独特血统成分，并有证据表明与郊狼有大量基因渗入，但与灰狼的基因渗入有限。 Wilson等人（2000）假设东部狼和红狼可能是同一物种，而Sacks等人（2021）则提出，东部狼是目前原始红狼“最纯正”的代表。 我们的结果表明，东部狼和红狼都经历了与其他犬科动物的近期基因渗入，但它们的基因组中仍然携带着私有的血统。 必须承认，仅从两个基因组得出的解释限制了这些数据的解释范围，需要更多的种群水平高覆盖度基因组和历史样本（即圈养繁殖计划之前的样本）来更好地阐明红狼的进化史。
五大湖狼和东部郊狼
我们的分析证实了五大湖狼和东部郊狼的混合血统，但它们的分类和时间起源不同。 基于mtDNA和Y染色体数据，五大湖狼被认为是灰狼和东部狼的杂交体，而东部郊狼被认为是“西部”郊狼和东部狼的杂交体。 与过去的研究相比，全基因组数据（本研究）表明，五大湖狼和东部郊狼或许更适合被分别视为灰狼和郊狼的独特种群，尽管它们受到了与东部狼基因渗入的影响。 我们注意到五大湖狼中有有限的郊狼基因渗入，东部郊狼中有有限的灰狼基因渗入，这很可能是通过东部狼作为桥梁基因流的结果。
五大湖狼可能起源于约8,000年前，在约9,000年前冰盖从五大湖地区退去之后。 ABC估计表明，安大略省的五大湖狼比之前对明尼苏达州同类狼的估计更为近期（7,899年 vs. 27,000-32,000年）。 先前的研究已证明，五大湖狼种群表现出源自灰狼和东部狼的mtDNA和Y染色体单倍型。 我们的结果表明，五大湖狼起源于灰狼和东部狼之间的一次古代基因渗入事件，但其血统主要为灰狼。 因此，五大湖狼或许最好被描述为受与东部狼古代基因渗入影响的灰狼的一个独特种群。 未来的研究应进一步调查占据加拿大中部和西部五大湖州混合林和北方森林中重要生态位的五大湖狼的起源和当前动态。
东部郊狼的起源时间太近，无法通过模拟模型可靠地确定日期。 这一发现与观察结果一致，即直到约1890年郊狼在五大湖地区都很罕见，并于1919年到达安大略省南部。 自然史记录表明，东部郊狼起源于上个世纪，是由于“西部”郊狼向东扩张过程中发生的杂交事件，这一扩张得益于土地开垦和大型捕食者的清除。 先前的研究发现，东部郊狼种群表现出源自郊狼和东部狼的mtDNA和Y染色体单倍型，以及源自家犬的Y染色体单倍型。 尽管我们承认，在我们的种群结构和基因渗入分析中缺乏家犬样本可能会对已知表现出家犬常染色体基因渗入的东部郊狼结果产生偏见，但我们的结果与先前的发现一致，表明东部郊狼起源于“西部”郊狼与东部狼和家犬之间近期的基因渗入事件，但仍保持着主要的郊狼血统。 因此，东部郊狼可以被描述为受与东部狼和家犬近期基因渗入影响的郊狼的一个独特种群。 鉴于灰狼-东部狼杂交的古代性和“西部”郊狼-东部狼杂交的历史性，我们建议将五大湖狼和东部郊狼称为基因渗入种群（admixed）而非杂交体（hybrids）是恰当的。 我们通过指出这两种犬科动物都发生了与亲本犬科动物类型的回交以及随后的隔离（至少在其核心活动范围内）来证明这一解释。
结论
在加拿大，基于遗传、形态和行为研究，东部狼已被承认为一个独特的物种。 根据联邦《濒危物种法》，东部狼在加拿大被列为“特别关注”物种，根据安大略省《濒危物种法》，在安大略省被列为“受威胁”物种。 尽管在加拿大，东部狼已被承认为一个独立于郊狼和灰狼的物种，但在其主要活动范围内，它们目前与东部郊狼和五大湖狼作为单一物种进行管理。 将这三个分类实体合并管理被认为是必要的，因为在野外视觉上区分野生犬科动物及其杂交体存在困难，这给执行狩猎和诱捕法规带来了挑战。
通过使用高覆盖度基因组和种群水平分析，我们调和了先前基于特定分子标记的出版物的结果。 东部狼确实是一个分类学上独特的实体，它经历了与灰狼和郊狼的古代和近期基因流。 考虑到我们的结果，并根据预防原则，东部狼可能需要继续得到保护，因为它们保留了一部分独特的遗传血统。 与郊狼和灰狼的古代杂交影响了现今东部狼的构成，使其难以与近期杂交区分开来。 从推测的更广阔的历史活动范围来看，“最纯正”形式的东部狼仅存留于安大略省中部和可能魁北克省南部的一个小区域内。 无论导致东部狼形成其当前形态的复杂过程如何，仍然存在一个独特的东部狼基因组特征，关于东部狼进化史的不确定性不应成为其保护的障碍。
以上为AI翻译，懒得附原文图了，直接附原始文献。
东狼起源2023.pdf
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